Căpitanul Duke Hauser (Channing Tatum) și echipa G.I. Joe sunt atacați în timpul nopții la baza operativă de către trupele de asalt ale armatei S.U.A. Acestea iau prin surprindere soldatii G.I. Joe care credeau că asistă la un antrenament nocturn și reușesc să-i elimine aproape pe toți. Singurii rămași în viață, căpitanul Duke Hauser, Roadblock (Dwayne Johnson) și Jaye (Adrianne Palicki) hotărăsc să ceară ajutorul experimentatului veteran Joe, pentru a face față noului inamic al omenirii, cel care a dat ordinul pentru ca gruparea G.I.Joe să fie anihilată complet, nimeni altul decât președintele Statelor Unite ale Americii (Jonathan Pryce).
Firefly (Ray Stevenson) și Zartan (Arnold Vosloo), pun la cale un plan de cucerire și control al lumii cu ajutorul organizației Cobra. Cei care se vor opune vor fi distruși fără milă de arsenalul nuclear pe care aceștia îl dețin în dotare.
Misiunea ultimilor agenți G.I.Joe rămași în viață va fi una aproape imposibilă, deoarece au fost declarați inamici ai statului și sunt vânați pentru a fi eliminați, însă dorința lor de răzbunare, curajul, tehnologia avansată pe care o dețin și abilitățile fizice ieșite din comun sunt atuurile prin care doresc să își doboare adversarii și să arate adevărul întregii lumi.